米国脊髄損傷資料集

米国脊髄損傷資料集

■　II―４　専門誌掲載論文から

軸索成長阻害因子が皮質脊髄索傷害後の
形成性と機能回復を抑制している

Michael Thallmair, Gerlinde A.S.Metz, Werner J.Z'Graggen,
Olivier Raineteau,Gwendolyn L.Kartje, Martin E.Schwab 共著

Nature neuroscience 誌 1998年６月号

　げっ歯動物の皮質脊髄索（CST）の傷害後の解剖学的形成性と機能回復は、ミエリン形成と平行して減少する。ミエリンがある軸索の成長阻害タンパク質は繊維の再成長を阻止する。しかしながらそういったタンパク質が傷害を負っていない繊維の活発な発生をも妨げるのかどうかは明らかになっていない。

　そこでここで示すのは、成長したネズミの脳幹で片側だけCST傷害をもった後、無傷な索と傷害を受けた索の両方に阻害タンパク質を中和する単クローンの抗体を用いた治療をすると、局所的に索が増殖するということである。

　抗体治療を受けた動物は運動と知覚試験で十分な回復を示した。一方、傷害をもっているが治療を受けないラットはひどい傷害が続いた。ミエリンがある軸索の成長阻害因子を中和するとこのように通常では胎児期にのみ見られる構造上の形成性や機能の回復が成体においてみられる。

　哺乳類の成体の中枢神経系（CNS）は傷害を負うと機能的、解剖的に回復する能力はかなり限られている。ミエリンとミエリンがある軸索の成長阻害因子NI-35/250は再生する神経繊維の増殖を妨げるのに重要であるようだ。ミエリンに対する阻害効果を中和する単クローン抗体(IN-1)は成体の皮質脊髄軸索が長い距離にわたって再生し、運動機能を回復するのを高める。成体の CNS と比べて胎児期の CNS は傷害を受けると、傷害を受けた繊維の再生と傷害を受けていない繊維の形成的な増殖が共に起こる。このことは高度な機能回復はこの時期に見られるということを説明している。

　げっ歯類の皮質脊髄索にとって、解剖学的機能的形成性は、生後髄鞘形成の始まりと進行とともに衰えるものである。脊髄でのミエリン形成を実験的に妨げると、成体のラットにおいては錐体（脳幹の一部）高さの CST の片側切断が作用して、健康な皮質脊髄索がミエリンのない脊髄の中心線を越えて神経を除去された領域にまで増殖する。

　錐体路切離術を用いて構造的形成性を研究するのには多くの利点がある。脳幹の CST 傷害は大きな脊髄損傷よりも他の神経繊維系が上行したり下行したりしにくくする。CST は２本の CST の間指標として脳底動脈とともに錐体のまさに外面を走っており、特別に片側だけを損傷することができる。動物の新生児では傷害を受けた CST や他の下行性神経索が芽生え、成体では傷害後そのような芽生えは見られないということは多くの研究で記されている。

　脊髄での通常の CST 神経支配のパターンはかなり特殊で、その中枢投射に関して十分に記されている。たとえば運動皮質の前肢起源の CST 投射は錐体の吻側に存在する赤核や橋核を局所的に刺激する。

　ここで脳幹下部での片側切断（錐体路切離）に応じて成長したげっ歯類の CSTでの神経繊維の形成増殖と機能回復について研究した。１つの実験では、傷害を受けていない CST に印をつけて頚部の脊髄におけるその動きを調べた。また別の実験で、傷害を受けた CST の前肢の脳幹投射に印をつけて、赤核と橋核での傷害箇所に対して吻側の投射の反応を研究した。

　同様にして投射の脊柱核による神経支配も研究した。前肢を使うには CST が無傷であることが必要であると信じられているため、我々の実験動物にはえさの粒をとるということで運動機能の回復をテストした。また前肢の着地や回転が悪い事を明らかにするために前肢足跡の分析も行った。粘着紙テストでは知覚機能の喪失と回復を調べた。

　これらのテストで CST の傷害は機能的損傷と繋がった。また解剖学的研究により傷害に応じる解剖学的変化はかなり限られていることを明らかにした。これと比較して、IN-1 抗体での治療を受けた動物はあらゆる行動分析に対して十分な機能的回復が見られた。そしてこれに伴い、傷害を受けた CST と対側の傷害を受けていない CST の両方が過度に増殖した。

結　果

　単クローン抗体 IN-1 はラットの NI-250ミエリンタンパク質（主な神経成長阻害因子成分）に対してであった。また IN-1 は牛やヒトの脊髄でのミエリン阻害活動と同様にラットの NI-35 も中和する。

　年令が２～３ヶ月のルイスラットの成体の両性について、延髄の高さで CST の片側に傷害を与えた。手術の際、西洋ワサビペルオキシダーゼ（生化学分析に試薬として用いられる）に反応する IN-1 か制御抗体のどちらかを産生しているハイブリド－マ細胞を、傷害と対側性の皮質に注射した。手術後投与されたシクロポリスン A（体重１００ｇにつき１mg）により、小型で抗体を産生するハイブリドーマ細胞の塊が増殖した。

　さらに傷害を受けたがハイブリドーマ細胞がないラットや、抗 HRP か IN-1 ハイブリドーマ（抗体のみ）のどちらかを用いて偽手術を受けたラットは制御をうけた。

　解剖学的研究のため、手をつけていない側や傷害を受けた側の感覚運動皮質に前転するトレーサーを使って手術の日に注射した。そしてそのラットを２週間後に潅流＊注した。第１のグループの実験で、頚部脊髄の損なわれていない（反対側の）CST に関する傷害と抗体治療の効果を研究した。第２のグループでは（傷害と）同じ側の繊維から対性の赤核と橋までの投射を研究した。第３のグループではラットを行動的に分析した。テスト期間後にこれらのラットの脳幹の脊柱核を分析した。
＊　特定の器官の血管を通して液を循環させること。

脊髄において傷害誘導性の芽生え

　ラットにおいて CST は脳幹内の錐体路交差でほぼ完全に交差する。このように大部分の繊維投射は後索を経て脊髄の反側の半分に達している。ほんの一部の繊維は錐体路交差で交差しないで脊髄前索と後索内で同側に続いている。制御を加えたグループでは、２週間後、傷害と反側の神経支配を除去した脊髄灰白質において、標識をつけた繊維の数がわずかに増えたことを観察した（傷害のみ又は抗体のみ、データは示されていない）。

　傷害を負って制御抗体治療をうけたラットでは、神経支配を除去した部分において同様な成長が散在することが示された。これに対し、傷害を IN-1 抗体で治療したラットは、神経支配除去部分に対する芽生えが著しく増加している。

　繊維は脊柱の中を通っている損なわれていない CST から成長し、脊柱交連あるいは変性した CST を通って脊髄中心線を越えて神経支配を除いた後角、中間角、前角（主にⅥとⅦの層）に枝をのばした。これらの新しく形成された副行路はボタン様の構造をしている。

　 IN-1 治療をしたグループでは中心線を越えている繊維の数が抗 HRP 抗体治療をしたラットと比べて２倍以上増加した。IN-1治療をうけたラットはまた傷害のみ、偽手術、抗体治療を受けたラットとも著しく異なった。一方で、抗 HRP 抗体治療を受けたラットと他の制御グループとの間には大きな違いはなかった。Fig.1d に見られる標準値は IN-1 治療グループ（n＝１０）において１秒あたり約 3.2 繊維、抗 HRP 抗体治療グループ（n＝１０）において１秒あたり約 1.8 繊維に相当する。

　試験的実験で、組み換えて人体で作られたものと同性質の IN-1Fab フラッグメントを浸透性のミニポンプで２週間、胸部脊髄上に注いだところ同様の傷害誘導性の芽生えが見られた。

IN-1 治療動物における新反側投射

　脳幹において我々は赤核と基底橋核を研究した。その構造は共に一次運動皮質からの強力な入力を受け取る。これらの核は小脳を経て運動支配にふくまれる。皮質繊維は主に赤核の小細胞の部分で終わっている。基底核においては核皮質部では別の末端パターンを有している。これらの投射は片側で、中心線を越えて反対側にある核と投射する繊維はほんのわずかである。

　傷害のみのラット（データはない）と制御抗体治療をうけたラットにおいて、いわゆる延髄皮質投射は、制御抗体治療をうけたラットの対側の末端がわずかに増加していることを除けば正常ラットとほぼ変わりなかた。これと比較してIN-1抗体で治療したラットは赤核の小細胞においても橋の尾の部分においても中心線を越える繊維の数がふえていた。基底橋核においては、末端叢び繊維密度の比較的大きな増加がIN-1治療をしたグループの同側部分で見られた。

　こういった末端部分を密時計で測ると正常ラットにおいて反対側成分が 8.3％なのに比べ IN-1 抗体治療をしたグループは 26.3％を示した。この繊維は適度な対側部分（橋の前肢部）を神経支配した。
IN-1 は脊柱核の神経再支配を増加する

　げっ歯類において脊柱核（DCN）と投射する副行索は交差のところで始まり反対側の DCN に神経を分布するために吻側方向へと拡がる。この神経分布パターンのために、脳幹レベルでの CSTの傷害は DCN の神経支配を完全に失う。

　行動テストを行った全動物グループにおいて DCN の神経支配は標識された受傷 CST と質的に比較された。受傷して抗 HRP 治療を受けた動物と同様に受傷のみの動物では DCN の神経再支配は全くあるいはほとんど見られなかった。これに対して、IN-1治療した動物の３分の２は DCN の神経再支配が密になった。

機能回復は構造的形成性と平行する

　 IN-1 抗体治療をしたラットにおいて構造的形成性が観察されることから、機能回復は解剖的変化と平行するのではないかという疑問が生じた。成体のルイスラットに２～３週間毎日餌の粒を取る訓練（試験装置 Fig.5)をさせて観察した（実験は次の５グループ：受傷のみ、偽手術と抗 HRP、偽手術と IN-1、傷害と抗 HRP、傷害とIN-1)。

　動物は手術と治療から２週間で回復がみとめられ、それから４週間毎日テストが行われた。術後訓練の最初の日に、受傷ラットのほとんどは同側の損傷していない前肢が届いた。術後の訓練中、ラットたちは反側の受傷した前肢に切り替えさせられた。ラットはつるつるした所から受傷した前肢をつかって餌の粒を取らなければならなかった。

　最初のテストでは固定した餌を食べるのにかかる時間を測った。手術前の測定では２０粒を掴んで食べるのに約７５秒かかっていた。手術４２日後では、受傷しただけのラットと受傷後抗 HRP 治療をしたラットは約１５０秒かかり、手術前の測定や偽手術をしたラットと比べてかなり多くの時間を要した。これに対し、偽手術をしたラットと受傷後 IN-1治療をしたラットは術前の測定と変わらなかった（７５秒）。

　第二に、固定していない１０粒を棚からとる成功率を記録した。術後４２日後、７粒を掴んだ偽手術をうけたラットと比べて受傷しただけのラットが掴んだ粒はかなり少ない（4.5粒）。受傷後 IN-1 治療をしたラットの成功率は偽手術をしたラットの成功率とほぼ同じである。受傷後 IN-1治療をしたラットと偽手術をしたラットでは術前の値と比べて成功率が増加した。これはおそらく術後の訓練によるものであろう。受傷しただけのラットと受傷後抗 HRP 治療をしたラットでは、通常CST傷害に続くものとして知られている欠損での成功率が低い。

　運動機能はまたロープ上りでも評価される。ラットがロープを上っている間、受傷側の足がすべった数を数えて、ステップ毎にすべった数を計算した。このテストは雌ラットで行われた。　

　手術後４２日に、受傷したのみのラットと受傷後抗 HRP 治療をしたラットは１０ステップ毎に 4.8 あるいは 4.5 回すべっていた。これに比べて偽手術のラットは１０ステップにつき2.5回であった。

　受傷後 IN-1 治療をしたラットは偽手術をしたラットと同様であった。術前の結果と比べると全てのラットが足をすべらせる回数が多くなっているのは体重の増加によるものと思われる。

　感覚機能の回復は体性感覚に特に敏感な紙テストで評価された。術後４２日で、ラットが前肢の掌状部から癒着性のテープを剥がすのに要する時間を受傷側と損傷のない側で測定した。偽手術のラットはどちらの側も１５秒以内で剥がした。

　 CST 損傷後は、損傷のない側からテープを剥がすのに３０秒かかった。損傷側の前肢からテープを剥がすのは平均１１０秒とかなり長い時間を要した。剥がし始めると動きは速く、この行動の運動構成要素にはあまり影響を与えていないことを示している。

　受傷後 IN-1 治療をしたラットは術前の値あるいは偽手術のラットと統計的な違いはない。受傷後 IN-1 治療ラットがテープを剥がすのは、受傷側と損傷を受けていない側のどちらからも同じ時間（２０秒）を要した。興味深いことに、DCN の神経再分布は受傷後IN-1治療ラットが受傷した前肢から速くテープを剥がすのに相互関係があった。

　我々は前肢を置く位置と回転を調べる目的で前肢の足跡を用いた。前肢の外回転、すなわち受傷側の外側への回転は受傷のみラットと受傷後抗HRP治療ラットにおいて術後４２日で著しく増加した（それぞれ２７°と２５°で、偽手術ラットと受傷後 IN-1 抗体治療ラットは２０°だった）。ストライドの長さやつま先の広がりは実験グループによる違いはなかった。

議　論

　この研究では、皮質脊髄索の片側に傷害を受けた成体のラットにおいてミエリンの阻害特性を中和する単クローン抗体 IN-1 により受傷で生じた構造的形成性が増加することを示し、結果として頚部脊髄、赤核、橋による両側の神経支配を示している。興味深いことに、受傷によって失われた脊柱核の神経支配も IN-1 で治療したラットで再構築された。さらに IN-1 治療で前肢の動きと感覚機能の機能的回復が見られた。

IN-1 は皮質遠心性路の形成性を高める

　単クローン抗体 IN-1は高分子量の新しいタンパク質（NI-250）で、ラットや牛、ヒトの CNS ミエリンにおいて神経突起成長阻害活動に効力があるとされている。

　我々の研究は、ミエリンに関与する神経突起の成長阻害活動が中和されるなら、成体の CNS において物質の構造的形成性（損傷を受けていない軸索と受傷した軸索からの繊維の成長）が起こるということを示す。

　この繊維の成長は脊髄と脳幹の両方でとても貴重であり局所的に特異である。繊維は傷害を受けていない CST から出てきて脊髄中心線を越え脊髄の神経がなくなった半分で分枝を形成した。新しい側枝のボタン様構造はシナプス末端の存在を示唆している。このように脊髄の神経をなくした半分は同側 CST の衰退に伴い通常の皮質入力を失っているが、構造的形成性は受傷していない反対側の CST に、故にもう一方の皮質半球に支配され得ることが観察された。

　 IN-1 治療ラットでは受傷 CST 索が受傷側を越えてあるいは周りで再生することがあるが、質的に弱い。これは軸索が錐体路交叉を通る困難のためであろう。

　我々の研究結果は早期の観察と一致する。その観察では新生児の損傷後脊髄レベルで CST 繊維の再交叉による異常な同側路について記されている。

　我々はまた皮質延髄索の芽生えをも観察した。皮質延髄は受傷した CST の吻側から傷害の位置まで達している。反対側の赤核や橋を支配している皮質延髄索の芽生えは脊髄で見られた芽生えと同様の結果であろう。これらの核に対する反対側の投射の増加によって脊髄への接近を失った皮質半球が以前の標的部への関節的な影響を（例えば小脳を経由して）得るかもしれない。

　面白いことに、新生の動物では感覚運動皮質の片側の傷害の後に同様の投射が発達する：損傷を受けていない皮質は赤核と基底橋核まで両方の側の投射をおくる。このようにミエリンの阻害特性を中和すると通常は新生児での受傷でしか見られない補正的構造的な形成性が見られる。

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